La chiesa, dedicata al Santo patrono Nicola di Bari, è una delle più belle e antiche di Genazzano. Essa compare per la prima volta nelle Conventiones, ossia gli statuti del paese risalenti al 1277, insieme a San Paolo e Santa Maria.
Collocata di fronte al Castello, faceva parte del Castelluccio, di cui era la chiesa ufficiale. A questa fu particolarmente legato Papa Martino V, nato a Genazzano e probabilmente battezzato proprio in questa chiesa. Grazie alla sua opera fu elevata a Collegiata e dotata di privilegi, reliquie e rendite, e venne ampliata in forme tardogotiche, rintracciabili nei capitelli dell’abside e nel portale laterale, e abbellita con la realizzazione del soffitto ligneo policromo e della spettacolare pavimentazione cosmatesca nella quale possono essere rintracciati frammenti di lapidi antiche e sepolcri medievali. Tra le lapidi murarie si distingue quella di una principessa gota, Flavia Amalafrida Theodinanda, relegata in esilio in una villa di Genazzano.
Tra le altre lapidi va ricordata quella della famiglia dell’eroe di Barletta, Giovanni Brancaleone, mentre una lapide più recente, risalente al XVII secolo, fu posta sulla rampa d’accesso al portale per ricordare la demolizione di una parte della chiesa fatta eseguire da Filippo Colonna nel 1616 per rettificare la via conducente al palazzo baronale per creare un corridoio ottico tra l’attuale Corso Vannutelli e la facciata del Castello. Nella parte demolita la chiesa si presentava su due livelli: in basso la cappella di S. Angelo, sacello funebre della famiglia Colonna che ospitava tra gli altri il sepolcro di Antonio, nipote di Martino V e principe di Salerno; sopra, la cappella di S. Martino in cui l’altare era sormontato da un ciborio in marmo. Anche l’altare maggiore, che si trovava al centro dell’abside, aveva un ciborio simile a quelli delle basiliche paleocristiane di Roma. L’altare fu demolito e ricostruito addossato alla parete di fondo a seguito della riforma liturgica del Concilio di Trento per il sacerdote doveva celebrare con le spalle ai fedeli.
Nel 1669 venne data l’autorizzazione per realizzare il nuovo altare in forme barocche, inserito in una maestosa composizione barocca in stucco bianco e oro costituita da un ordine gigante di quattro colonne corinzie sormontate da una trabeazione mistilinea. Le due colonne centrali incorniciano un’edicola in cui è inserito il quadro di San Nicola con la Vergine e il Bambino del pittore genazzanese Carlo Ascenzi, e sorreggono un attico dal timpano curvilineo con al centro lo Spirito Santo accompagnato da una teoria di angeli in altorilievo di mirabile fattura, che dialogano con quelli altrettanto pregevoli a tutto tondo posizionati sul timpano e sulle due colonne più esterne.
Le due cappelle ai lati dell’abside furono realizzate intorno al 1620, dopo la demolizione della parte anteriore della chiesa per compensare la perdita. Quella di destra fu dedidata a san Filippo Neri, proclamato beato nel 1615, di cui il principe Filippo portava il nome per grazia ricevuta dalla madre Anna Borromeo. Quella di sinistra fu dedicata a S. Michele Arcangelo, ovvero S. Angelo, come la precedente cappella funeraria.
L’aspetto attuale della navata centrale, scandita da un ordine gigante di lesene, e delle due navate laterali, con gli altari tutti uguali, risale al 1780, quando un importante intervento di trasformazione per regolarizzare gli spazi che si presentavano asimmetrici inglobò le strutture quattrocentesche ancora intuibili nel pilastro sinistro, in cui si scorge inglobata una colonna, e sul paramento murario dove sono rintracciabili crepe dovute al riempimento che seguono il profilo dei più antichi archi ogivali.
L’organo, situato sulla cantoria al di sopra del portale maggiore, opera della famosa famiglia di organari dei Catarinozzi, e il coro ligneo nell’abside risalgono alla metà del Settecento.
Dopo circa 30 anni di chiusura e successive fasi di restauro, la Chiesa riportata ai suoi antichi splendori è stata riaperta nel 2013.